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    原位雜交-典型實驗方案背景

    檢測樣品:細胞檢測項目:原位雜交

    方案概述:CEM集團的子公司Intavis 公司從2007年開始向全球推出了適用于全組織和切片標本的自動化原位雜交及免疫組化系列產品。通過對以往型號的大幅改進,使得InsituPro 更加滿足用戶的需求并使得用戶對實驗的應用更加高效。

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    更新時間2022年08月05日

    上傳企業培安有限公司

    下載方案

    原位雜交1.jpg

     

    復水(有時候也用到脫水,只是順序相反)

    溫度:環境

    描述:通過一系列的緩沖液交換將樣品從在100% 甲醇或乙醇的儲存條件中轉移到水緩沖液中。通常從100%的乙醇交換到75%、50%、25%、0%,每次交換后留5 min進行平衡即可。如脫水進行太快或不進行脫水,樣品形態將被破壞,甚至被撕成碎片。

    漂白(可選

    溫度:環境

    描述:通常與3%的過氧化氫孵育,以擺脫內部的過氧化物酶和漂白暗色的胚胎

     

    烷基化(可選,INTAVIS儀器不能完成)

    溫度:環境

    描述:三乙醇胺中的乙酸酐用于使組織帶負電荷,從而降低背景。它被廣泛應用,特別是在植物領域,用極少的探針就可以增強結果。

    自動化時:乙酸酐在溶液中非常不穩定,它在制備后能用于孵育的時間不超過一分鐘,因此不可能實現自動化(并且探針通常不需要)。

    原位雜交3.jpg

     

    細胞壁消化(可選,只在植物中)

    溫度:環境

    描述:植物樣品中主要使用鹽酸水解細胞壁?;蛘呷绫罎⒚负屠w維素酶等酶類也能被使用。

     

    滲透(時間要求嚴格)

    溫度:環境或37℃

    描述:使探針能接觸樣品組織至關重要。這步處理通常使用蛋白酶,主要是蛋白酶K,但鏈霉蛋白酶和其他蛋白酶也能被使用。但也有其他的處理方法,如熱處理(蒸汽)或與洗滌劑混合物孵育。對于蛋白酶K,甘氨酸通常被用來立即停止蛋白酶K的作用,或者通過數次換液將蛋白酶K 洗掉。滲透后,通常會使用多聚甲醛進行固定。

    自動化時:所有蛋白酶應足夠穩定,到使用前不會自我分解,如蛋白酶K。

     

    雜交

    溫度:通常50-70℃(RNAse 在37℃)

    描述:雜交由幾步組成:

    1,預雜交步驟(可選)逐步交換雜交 緩沖液,并封閉非特異結合位點

    2,雜交步驟,與探針孵育

    3,雜交后洗滌步驟,用越來越嚴格的緩沖液進行多次洗滌

    4,通常在雜交后洗脫步驟之間,進行RNAse消化(可選)來擺脫未結合的探針減少背景:RNAse緩沖液洗滌,用RNAse處理,再次RNAse緩沖液洗滌,所有步驟在37℃進行。

    5,更多的雜交后洗滌

    原位雜交2.png

     

    抗體孵育

    溫度:環境或更低

    描述

    在此步驟中,抗體與探針上的抗原結合

    1. 用封閉試劑封閉(如Roche 封閉試劑,BSA,山羊或綿羊血清)。在這一步,所有非特異抗體結合位點將被蛋白飽和

    2, 與抗體孵育,讓抗體抗原結合

    3, 洗滌步驟,洗滌未結合抗體

    自動化時:由于基本上所有檢測探針的抗體都是商業化的,它們室溫下工作并具有相同的特異性??贵w結合在室溫下更快結合。

     

    與堿性磷酸酶緩沖液孵育(如NTMT

    溫度:環境

    描述:與新鮮制備的緩沖液孵育,為堿性磷酸酶顏色反應做準備

    自動化時:使用堿性磷酸酶偶聯抗體時,緩沖液儲存過久或使用前制備時會沉淀。

     

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